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三種紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量

日期:2024-10-19 06:17
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摘要:三種紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量
那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下三種紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1. 280nm的光吸收法
因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有**大吸收,且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大,因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是**常用的紫外吸收法。
測(cè)定時(shí),將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑(水或緩沖液)作空白對(duì)照,在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿,盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí),a280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。
許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值(A1%1cm)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查,根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與(A1%1cm)值(即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%,光徑為1cm時(shí)的光吸收值)的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)1%1cm,稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。
蛋白質(zhì)濃度 = (A280′10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%濃度  10mg/ml)
例:牛血清清蛋白 : A1%1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 :   A1%1cm=22.8 (280nm)
若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的A1%1cm值,則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白(BSA)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:取6支試管,按下表編號(hào)并加入試劑:
管號(hào) 1 2 3 4 5 6
BSA(1.0mg/ml) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管為空白對(duì)照,各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度A280,以A280為縱座標(biāo),各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo)作圖,標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線,利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A280值,即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量,也可以用2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A1%1cm,280nm
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收,在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍(每克),但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng),其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍,而蛋白質(zhì)則相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常:
純蛋白質(zhì)的光吸收比值:A280/A260  = 1.8
純核酸的光吸收比值: A280/A260 = 0.5
含有核酸的蛋白質(zhì)溶液,可分別測(cè)定其A280和A260,由此吸收差值,用下面的經(jīng)驗(yàn)公式,即可算出蛋白質(zhì)的濃度。
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260
此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。
3. 215nm與225nm的吸收差法
蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí),可用215nm與225nm吸收值之差,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。
用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),配制成20~100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液,分別測(cè)定215nm和225nm的吸光度值,并計(jì)算出吸收差:
吸收差d= A215 -A225
以吸收差d為縱座標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)出未知樣品的吸收差,即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于三種紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量。
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