蛋白純化系統(tǒng)、超微量核酸蛋白測(cè)定儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)、雙光束核酸蛋白檢測(cè)儀、紫外分析儀、紫外檢測(cè)儀、恒流泵、自動(dòng)部分收集器等為**的十幾個(gè)產(chǎn)品系列
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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白等電聚焦凝膠電泳技術(shù)（一）
日期：2024-11-23 10:30
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摘要：1.原理
等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點(diǎn)進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場(chǎng)中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。
1.原理
等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點(diǎn)進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場(chǎng)中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時(shí)，才能獲得較好的蛋白質(zhì)條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統(tǒng)（否則會(huì)導(dǎo)致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時(shí)比較多種蛋白質(zhì)樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對(duì)蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感，若要好的重復(fù)性，制備蛋白樣品時(shí)一定要小心，要避免任何對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的修飾。另外，蛋白質(zhì)－脂類、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可引起電荷改變，進(jìn)而導(dǎo)致等電點(diǎn)遷移或紋理現(xiàn)象。除非特殊需要研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用或者必須保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
2.主要儀器、試劑
儀器：微型電泳系統(tǒng)、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質(zhì)、尿素、過(guò)硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三***、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、乙酸。
儲(chǔ)存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三***；4）1%三***；5）1%溴酚藍(lán)；6）考馬斯亮藍(lán)染色液；7）考馬斯亮藍(lán)脫色液；
3.載體兩性電解質(zhì)的選擇
載體兩性電解質(zhì)是一些具有相近等電點(diǎn)的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時(shí)配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質(zhì)的配方：
4.灌膠
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來(lái)配置。
水：5.4ml； 儲(chǔ)存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過(guò)硫酸胺25μl； TEMED：20μl
灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質(zhì)溶液混勻，避免劇烈搖動(dòng)，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過(guò)硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產(chǎn)生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內(nèi)（不要產(chǎn)生氣泡）；6）聚合約1小時(shí)；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前好用陽(yáng)極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。
注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過(guò)程中會(huì)發(fā)生聚合；2）現(xiàn)在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統(tǒng)（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數(shù)目會(huì)有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔大上樣量大約15μl。
變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質(zhì)：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質(zhì)：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍(lán)：200μl
5.電泳
操作步驟：
1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質(zhì)沉淀；2）用微量注射器將蛋白質(zhì)樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來(lái)。注意：對(duì)于考馬斯亮藍(lán)染色液來(lái)說(shuō)，每個(gè)泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。
電泳液：
1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲(chǔ)存液新鮮配置）；
2）下槽中加入陽(yáng)極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲(chǔ)存液新鮮配置）。
等電聚焦電泳條件：
1）接好電極；
2）恒壓150V電泳30min；
3）恒壓200V電泳2.5h，開始時(shí)候控制電流為10mA左右，在聚焦過(guò)程中電流有所下降，電泳內(nèi)室溫度在電泳的過(guò)程中將升至40－50攝氏度。
6．電泳聚焦后處理
測(cè)定pH梯度：
1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；
2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）測(cè)讀此KCl溶液的pH值、
凝膠的固定：
1）將凝膠于10%三***中浸泡10min；
2）換成1%三***溶液繼續(xù)浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質(zhì)，浸泡過(guò)夜可以更好的降低考馬斯亮藍(lán)對(duì)載體兩性電解質(zhì)的染色。
凝膠的染色：用考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，制成干膠。
7.天然等電聚焦電泳的修正方案
如果要進(jìn)行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；
1） 膠過(guò)程中配的凝膠中不需要加尿素；
2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質(zhì)（同制膠成分），3ml甘油，上樣時(shí)候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；
3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。
等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點(diǎn)進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場(chǎng)中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時(shí)，才能獲得較好的蛋白質(zhì)條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統(tǒng)（否則會(huì)導(dǎo)致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時(shí)比較多種蛋白質(zhì)樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對(duì)蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感，若要好的重復(fù)性，制備蛋白樣品時(shí)一定要小心，要避免任何對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的修飾。另外，蛋白質(zhì)－脂類、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可引起電荷改變，進(jìn)而導(dǎo)致等電點(diǎn)遷移或紋理現(xiàn)象。除非特殊需要研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用或者必須保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
2.主要儀器、試劑
儀器：微型電泳系統(tǒng)、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質(zhì)、尿素、過(guò)硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三***、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、乙酸。
儲(chǔ)存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三***；4）1%三***；5）1%溴酚藍(lán)；6）考馬斯亮藍(lán)染色液；7）考馬斯亮藍(lán)脫色液；
3.載體兩性電解質(zhì)的選擇
載體兩性電解質(zhì)是一些具有相近等電點(diǎn)的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時(shí)配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質(zhì)的配方：
4.灌膠
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來(lái)配置。
水：5.4ml； 儲(chǔ)存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質(zhì)溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過(guò)硫酸胺25μl； TEMED：20μl
灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質(zhì)溶液混勻，避免劇烈搖動(dòng)，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過(guò)硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產(chǎn)生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內(nèi)（不要產(chǎn)生氣泡）；6）聚合約1小時(shí)；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前好用陽(yáng)極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。
注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過(guò)程中會(huì)發(fā)生聚合；2）現(xiàn)在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統(tǒng)（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數(shù)目會(huì)有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔大上樣量大約15μl。
變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質(zhì)：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質(zhì)：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍(lán)：200μl
5.電泳
操作步驟：
1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質(zhì)沉淀；2）用微量注射器將蛋白質(zhì)樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來(lái)。注意：對(duì)于考馬斯亮藍(lán)染色液來(lái)說(shuō)，每個(gè)泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。
電泳液：
1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲(chǔ)存液新鮮配置）；
2）下槽中加入陽(yáng)極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲(chǔ)存液新鮮配置）。
等電聚焦電泳條件：
1）接好電極；
2）恒壓150V電泳30min；
3）恒壓200V電泳2.5h，開始時(shí)候控制電流為10mA左右，在聚焦過(guò)程中電流有所下降，電泳內(nèi)室溫度在電泳的過(guò)程中將升至40－50攝氏度。
6．電泳聚焦后處理
測(cè)定pH梯度：
1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；
2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）測(cè)讀此KCl溶液的pH值、
凝膠的固定：
1）將凝膠于10%三***中浸泡10min；
2）換成1%三***溶液繼續(xù)浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質(zhì)，浸泡過(guò)夜可以更好的降低考馬斯亮藍(lán)對(duì)載體兩性電解質(zhì)的染色。
凝膠的染色：用考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，制成干膠。
7.天然等電聚焦電泳的修正方案
如果要進(jìn)行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；
1） 膠過(guò)程中配的凝膠中不需要加尿素；
2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質(zhì)（同制膠成分），3ml甘油，上樣時(shí)候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；
3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。