磷酸化蛋白WB太難了，踩坑無數(shù)后我們總結(jié)了這7條

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蛋白磷酸化，是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸殘基上添加磷酸基團(tuán)的一種可逆的翻譯后修飾，也是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究繞不開的話題。

      WB 難，一入 WB 深似海，磷酸化蛋白的 WB 檢測(cè)更是難上加難！因?yàn)橐坏┘?xì)胞裂解，就會(huì)釋放出蛋白酶和磷酸酶，可以降解或修飾蛋白質(zhì)，從而影響檢測(cè)結(jié)果。怎么搞定？別急，告訴你 7 個(gè)小妙招：

① 將樣品置于冰上，使用預(yù)冷的緩沖液
樣品處理中使用的設(shè)備或緩沖液應(yīng)在冰上（4 ℃）冷藏保存。盡可能使用預(yù)冷的試劑和設(shè)備，可以減緩去磷酸化、蛋白水解和變性。
②  使用磷酸酶抑制劑
在裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑，否則輕者條帶不明顯，重者沒有條帶。*好是添加新鮮配制的蛋白酶-磷酸酶抑制劑混和物。
③ 將樣品儲(chǔ)存在上樣緩沖液（loading buffer）中
蛋白定量后，將樣品與上樣緩沖液混合，遏制磷酸酶活性。隨后可以將樣本等分并儲(chǔ)存在冰箱中或加載到凝膠上。
④  避免使用牛奶作為封閉劑
牛奶中含有大量的一種磷蛋白——酪蛋白，會(huì)引起高背景。建議使用牛血清白蛋白BSA或無蛋白的封閉劑。
⑤ 使用無磷酸鹽緩沖液
為盡量減少非特異性信號(hào)，用 TBST 代替磷酸鹽緩沖液（PBS）。如果在中間步驟中必須使用 PBS，則應(yīng)在加入蛋白檢測(cè)底物前，用大量 TBST 清洗膜，以除去過量的磷酸鈉。
⑥ 使用靈敏的底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
如需檢測(cè)一種弱磷酸化的低豐度蛋白，可使用抗體對(duì)蛋白進(jìn)行免*疫沉淀獲得濃縮的蛋白，并在泳道中上樣更多的蛋白，同時(shí)使用高靈敏度的底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
⑦ 檢測(cè)總蛋白含量
為確定 WB 上信號(hào)的缺失是由于磷酸化效率低還是磷酸化蛋白分離不充分，同時(shí)需要檢測(cè)總蛋白含量。例如，使用配對(duì)抗體檢測(cè)磷酸化和未修飾的蛋白。

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