蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)方法經(jīng)典攻略 （一）

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不迷路

在結(jié)構(gòu)研究和體外生物化學(xué)分析等很多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中都需要用到純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以從組織中獲取，亦或更經(jīng)常的是從模式生物中過(guò)量表達(dá)獲得，如細(xì)*菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等。蛋白質(zhì)純化主要是根據(jù)它們各不相同的物理性質(zhì)來(lái)從原料進(jìn)行分離，其目的就是希望能浪費(fèi)*少的雜蛋白，獲得*多的功能蛋白質(zhì)。一個(gè)好的蛋白質(zhì)的純化過(guò)程必須要將其純化工藝步驟優(yōu)化至*少。

建立蛋白質(zhì)純化工藝時(shí)，*重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的數(shù)量及純度都必須滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。而且，因?yàn)楹罄m(xù)研究需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)行為的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過(guò)程中，很多處理方法都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細(xì)計(jì)劃，在*短時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在*穩(wěn)定的條件下進(jìn)行保存才算是成功地完成了其整個(gè)純化過(guò)程。

每一步純化過(guò)程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對(duì)其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個(gè)良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對(duì)蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。
緩沖液是一種含有共軛酸/堿對(duì)的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時(shí)的pH值 （圖1）。

Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當(dāng)pH=8.06，50%的Tris是質(zhì)子化（酸式結(jié)構(gòu)），50%是去質(zhì)子化（堿式結(jié)構(gòu)）。
關(guān)于緩沖液的一個(gè)常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時(shí)有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時(shí)可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。

一種好的緩沖液必須具有以下特征  :

1、水溶性

2、化學(xué)穩(wěn)定性

3、在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力

4、與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件具有良好的兼容性

5、與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性

很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。*常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種*常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對(duì)蛋白質(zhì)純化過(guò)程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點(diǎn)。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。

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