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PCR實(shí)驗(yàn)如實(shí)預(yù)防實(shí)驗(yàn)污染

日期:2024-10-23 01:45
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摘要: 進(jìn)行PCR操作時,操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守些操作規(guī)程,大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜污染的出現(xiàn)。 1.劃分操作區(qū):目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實(shí)現(xiàn)完全閉管操作,但無論是否能夠達(dá)到單人單管,均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行: (1)標(biāo)本處理區(qū),包括擴(kuò)增摸板的制備。 (2)擴(kuò)增區(qū),包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增。 (3)產(chǎn)物分析區(qū),凝膠電泳分析,產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。 (4)各工作區(qū)要有定的隔離,操作器材專用,要有定的方向性...

進(jìn)行PCR操作時,操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守些操作規(guī)程,大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜污染的出現(xiàn)。

1.劃分操作區(qū):目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實(shí)現(xiàn)完全閉管操作,但無論是否能夠達(dá)到單人單管,均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行:

(1)標(biāo)本處理區(qū),包括擴(kuò)增摸板的制備。

(2)擴(kuò)增區(qū),包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增。

(3)產(chǎn)物分析區(qū),凝膠電泳分析,產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

(4)各工作區(qū)要有定的隔離,操作器材專用,要有定的方向性。如:標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

切記:產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

2.分裝試劑:PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA:

(1) PCR用水應(yīng)為壓的雙蒸水。

(2) 引物和dNTP用壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制。

(3)引物和dNTP應(yīng)分裝儲存,分裝時應(yīng)標(biāo)明時間,以備發(fā)生污染時查找原因。

3. 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng):盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之。因此,不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意:

(1)戴次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套。

(2)使用次性吸頭,嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染。

(3)避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

(4)操作多份樣品時,制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的度。

(5)后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管。

(6)操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照,即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。

(7)盡可能用可替換或可壓處理的加樣器,由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,好使用可替換或壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。

(8)重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果,慎下結(jié)論。

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