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熒光定量PCR常用術(shù)語
日期：2024-10-22 16:49
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摘要：基線：基線是早期循環(huán)的噪點水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測量，這是因為在此期間還檢測不到擴增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計算基線的循環(huán)數(shù)量是可以改變的，如果使用模板量或者靶標基因的表達水平則循環(huán)數(shù)量需要減少。設(shè)置基線需要查看線性度擴增曲線的熒光數(shù)據(jù)。設(shè)置基線，使得擴增曲線的增長所開始的循環(huán)圈數(shù)大于基線循環(huán)圈數(shù)。對每個靶標序列都需要單獨設(shè)置基線。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的新版本允許單個樣品自動化基線設(shè)置。
本底：是指反應(yīng)中的非特異...
基線：基線是早期循環(huán)的噪點水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測量，這是因為在此期間還檢測不到擴增產(chǎn)物引起的熒光值增加。用于計算基線的循環(huán)數(shù)量是可以改變的，如果使用模板量或者靶標基因的表達水平則循環(huán)數(shù)量需要減少。設(shè)置基線需要查看線性度擴增曲線的熒光數(shù)據(jù)。設(shè)置基線，使得擴增曲線的增長所開始的循環(huán)圈數(shù)大于基線循環(huán)圈數(shù)。對每個靶標序列都需要單獨設(shè)置基線。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去。各種real-timePCR軟件的新版本允許單個樣品自動化基線設(shè)置。
本底：是指反應(yīng)中的非特異性熒光值，例如，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數(shù)學(xué)除去。
報告基因信號 ：在real-time PCR過程中由SYBR Green或熒光標記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。
歸化報告信號（RN）：這是報告染料熒光強度除以在每個循環(huán)中測量的被動參照染料的熒光強度。
被動參比染料 ：在某些real-time PCR中，熒光染料ROX被用作熒光信號標準化內(nèi)部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準確、孔位置及熒光波動造成的變動。
閾值：閾值調(diào)整到本底值之上并顯著低于擴增曲線的平穩(wěn)值。它必須處于擴增曲線的線性區(qū)域內(nèi)，代表了PCR檢出的對數(shù)線性范圍。閾值應(yīng)在對數(shù)擴增曲線視圖中進行設(shè)置，以使PCR的對數(shù)線性期易于識別。如果real-time PCR中有多個目標基因，閾值必須為每個目標進行設(shè)定。
循環(huán)閾值(CT)或交叉點（CP）：擴增曲線穿過閾值的循環(huán)（即，熒光檢測值顯著增加的點）。CT可以是個分數(shù)，并且可以計算起始模板量。
ΔCT值： ΔCT值描述了靶標基因和相應(yīng)的內(nèi)參基因CT值的差值，例如看基因，并用于標準化模板的使用量：
ΔCT = CT (靶標基因) – CT (內(nèi)源性參比基因)
ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感興趣樣品（例如，刺激細胞）的平均ΔΔCT值與參考樣本（例如，未刺激細胞）的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱為校準樣品，并且所有其它樣品進行相對定量時都將被標準化到如此：
ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)
內(nèi)源性參比基因：e這種基因的表達水平在樣品間不存在差異，例如看基因(3)。對比內(nèi)參基因與靶標基因的CT值可以將靶標基因的表達水平歸化到輸入的RNA或cDNA的量（見上面關(guān)于ΔCT值部分）。反應(yīng)中模板的確切數(shù)量不確定。內(nèi)參基因?qū)σ韵虑闆r作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量、逆轉(zhuǎn)錄效率、核酸回收和樣品處理的變動。為了選出的參照基因（多個），我們對算法進行了改進，允許其選擇依賴于實驗設(shè)置參照（4）。
內(nèi)參：在同反應(yīng)中被作為靶序列擴增的，并用不同的探針（即，進行雙重PCR）檢測的對照序列。內(nèi)參經(jīng)常被用來排除失敗的擴增，例如沒有檢測到目標序列的情況。
標定樣品：在相對定量中使用的參比樣品（例如，源自細胞株或組織純化的RNA），用以與所有其他樣品進行比較，以確定某基因的相對表達水平。標定樣品可以是任何樣品，但通常是個對照品（例如，未處理的樣品或來自實驗零時的樣品）。
陽性對照：使用已知量模板的對照反應(yīng)。陽性對照通常用來檢查引物集或引物–探針集工作是否正常，以及反應(yīng)是否正確設(shè)置。
無模板對照（NTC）：包含除模板之外的所有擴增反應(yīng)所必要組分的對照反應(yīng)。這使得發(fā)現(xiàn)由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能，例如從以前的PCR中。
無RT對照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測不被設(shè)計為僅檢測和擴增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進行檢測。DNA污染可以通過操作在其中沒有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的RT對照反應(yīng)來進行檢測。
標準品：已知濃度或拷貝數(shù)，用于構(gòu)建標準曲線的樣品。
標準曲線：要生成標準曲線，CT值/不同標準稀釋的交叉點對標準物質(zhì)輸入量的對數(shù)繪圖。標準曲線通常是使用至少5種不同濃度的標準稀釋倍比生成。每個標準曲線，應(yīng)檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間。標準是各濃度式三份的理想測定值。標準曲線的斜率如果與這些值差異較大則應(yīng)該舍棄。
本底：是指反應(yīng)中的非特異性熒光值，例如，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數(shù)學(xué)除去。
報告基因信號 ：在real-time PCR過程中由SYBR Green或熒光標記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。
歸化報告信號（RN）：這是報告染料熒光強度除以在每個循環(huán)中測量的被動參照染料的熒光強度。
被動參比染料 ：在某些real-time PCR中，熒光染料ROX被用作熒光信號標準化內(nèi)部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準確、孔位置及熒光波動造成的變動。
閾值：閾值調(diào)整到本底值之上并顯著低于擴增曲線的平穩(wěn)值。它必須處于擴增曲線的線性區(qū)域內(nèi)，代表了PCR檢出的對數(shù)線性范圍。閾值應(yīng)在對數(shù)擴增曲線視圖中進行設(shè)置，以使PCR的對數(shù)線性期易于識別。如果real-time PCR中有多個目標基因，閾值必須為每個目標進行設(shè)定。
循環(huán)閾值(CT)或交叉點（CP）：擴增曲線穿過閾值的循環(huán)（即，熒光檢測值顯著增加的點）。CT可以是個分數(shù)，并且可以計算起始模板量。
ΔCT值： ΔCT值描述了靶標基因和相應(yīng)的內(nèi)參基因CT值的差值，例如看基因，并用于標準化模板的使用量：
ΔCT = CT (靶標基因) – CT (內(nèi)源性參比基因)
ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感興趣樣品（例如，刺激細胞）的平均ΔΔCT值與參考樣本（例如，未刺激細胞）的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱為校準樣品，并且所有其它樣品進行相對定量時都將被標準化到如此：
ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)
內(nèi)源性參比基因：e這種基因的表達水平在樣品間不存在差異，例如看基因(3)。對比內(nèi)參基因與靶標基因的CT值可以將靶標基因的表達水平歸化到輸入的RNA或cDNA的量（見上面關(guān)于ΔCT值部分）。反應(yīng)中模板的確切數(shù)量不確定。內(nèi)參基因?qū)σ韵虑闆r作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量、逆轉(zhuǎn)錄效率、核酸回收和樣品處理的變動。為了選出的參照基因（多個），我們對算法進行了改進，允許其選擇依賴于實驗設(shè)置參照（4）。
內(nèi)參：在同反應(yīng)中被作為靶序列擴增的，并用不同的探針（即，進行雙重PCR）檢測的對照序列。內(nèi)參經(jīng)常被用來排除失敗的擴增，例如沒有檢測到目標序列的情況。
標定樣品：在相對定量中使用的參比樣品（例如，源自細胞株或組織純化的RNA），用以與所有其他樣品進行比較，以確定某基因的相對表達水平。標定樣品可以是任何樣品，但通常是個對照品（例如，未處理的樣品或來自實驗零時的樣品）。
陽性對照：使用已知量模板的對照反應(yīng)。陽性對照通常用來檢查引物集或引物–探針集工作是否正常，以及反應(yīng)是否正確設(shè)置。
無模板對照（NTC）：包含除模板之外的所有擴增反應(yīng)所必要組分的對照反應(yīng)。這使得發(fā)現(xiàn)由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能，例如從以前的PCR中。
無RT對照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測不被設(shè)計為僅檢測和擴增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進行檢測。DNA污染可以通過操作在其中沒有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的RT對照反應(yīng)來進行檢測。
標準品：已知濃度或拷貝數(shù)，用于構(gòu)建標準曲線的樣品。
標準曲線：要生成標準曲線，CT值/不同標準稀釋的交叉點對標準物質(zhì)輸入量的對數(shù)繪圖。標準曲線通常是使用至少5種不同濃度的標準稀釋倍比生成。每個標準曲線，應(yīng)檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間。標準是各濃度式三份的理想測定值。標準曲線的斜率如果與這些值差異較大則應(yīng)該舍棄。
效率和斜率：標準曲線的斜率了對real-time PCR的效率指示。斜率–3.322表示該PCR具有數(shù)值為1的效率，或的效率，并且PCR產(chǎn)物的量在每個循環(huán)增加到兩倍。效率小于–3.322（例如，–3.8）則表示PCR的效率<1。通常，大多數(shù)擴增反應(yīng)因為實驗的限制不能達到的效率。斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于的。當在反應(yīng)中的非線性期對值進行測量時可能發(fā)生這種情況，或者它可以指示是否有抑制劑存在。
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