PCR原理與應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReactionm,PCR)是項體外基因擴(kuò)增技術(shù),1985年美PE公司人類遺傳研究室發(fā)明了該項技術(shù),Saiki等先應(yīng)用于鐮狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷,但由于操作方法繁瑣未能**推廣應(yīng)用。直到1988年耐熱DNA聚合酶(Taq酶)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,使PCR技術(shù)變得為簡單,才被迅速應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等域,PCR技術(shù)已經(jīng)作為分子生物學(xué)發(fā)展道路上個里程碑，永載史冊。
()PCR技術(shù)的基本原理
   類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
   ① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
   ② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；
  ③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍(Plateau)。 到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。在此同時認(rèn)識到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。

    50年代初Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分實驗中已發(fā)現(xiàn)微粒體(microsome)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對它們在合成蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)運氨基酸的功能提出了假設(shè)；1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過程中mRNA與核糖體的結(jié)合；1965年Holley次測出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的結(jié)構(gòu)；特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認(rèn)識了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過程。
    從分子生物學(xué)的發(fā)展過程，可以看到在近半個世紀(jì)中它是生命科學(xué)范圍發(fā)展為迅速的個前沿域，推動著整個生命科學(xué)的發(fā)展。至今分子生物學(xué)仍在迅速發(fā)展中，新成果、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但分子生物學(xué)的歷史還短，積累的資料還不夠。例如：在地球上千姿萬態(tài)的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類所了解的只是少的部分，還未認(rèn)識核酸、蛋白質(zhì)組成生命的許多基本規(guī)律；又如即使到2005年我們已經(jīng)獲得人類基因組DNA3×109bp的全序列，確定了人的5-10萬個基因的結(jié)構(gòu)，但是要徹底搞清楚這些基因產(chǎn)物的功能、調(diào)控、基因間的相互關(guān)系和協(xié)調(diào)，要理解80%以上不為蛋白質(zhì)編碼的序列的作用等等，都還要經(jīng)歷漫長的研究道路?？梢哉f分子生物學(xué)的發(fā)展前景光輝燦爛，道路還會艱難曲折。
    ④、特異性強(qiáng) 作為引物的寡核苷酸與模板結(jié)合的正確性是決定反應(yīng)產(chǎn)物是否特異的關(guān)鍵。
　?、?、對原始材料質(zhì)量要求低 含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者總RNA，就可以用做反應(yīng)起始材料來獲取目的產(chǎn)物。
（）PCR技術(shù)的應(yīng)用
1、生命科學(xué)
　　a、人類基因組計劃 隨著的PCR日臻完善，科學(xué)于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎(chǔ)上，經(jīng)過整理、分類和排列后得到的更加準(zhǔn)確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的次揭示，表明科學(xué)們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊涵的內(nèi)容。
　　b、后基因組計劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中重要成為人們關(guān)心的熱點。以研究基因功能為**的“后基因組時代”已經(jīng)來臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及**基因組的研究計劃已經(jīng)成為新的熱點。
　　c、物種的分類、進(jìn)化及親緣關(guān)系 可以進(jìn)行物種進(jìn)化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。
2、醫(yī)藥
　　a、**的診斷和** 遺傳性**：如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的**，尤其是老年性**，如糖尿病、血脂癥、甚至腫瘤中的部分，均可預(yù)測；*基因的檢測和診斷：檢測惡性腫瘤的標(biāo)記物來診斷*癥等**；利用基因**方法**腫瘤性**。
　　b、致病病原體的檢測 檢測范圍包括**、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等切微生物。檢測的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)于當(dāng)前的**學(xué)方法，所需時間也已達(dá)到臨床要求，這對于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），**（如結(jié)核、***）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。
　　c、DNA指紋、個體識別（DNA身份證）、親子關(guān)系鑒別和法醫(yī)物證 可以用根頭發(fā)、個細(xì)胞、個精子來完成上述工作，這域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型。
　　d、生物工程制藥 許多**可通過工程菌和細(xì)胞來大量生產(chǎn)，如干擾素、白介素、促紅細(xì)胞生長素等**。
　　e、轉(zhuǎn)基因動物制藥及**模型 轉(zhuǎn)基因動物與醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)藥研究的關(guān)系越來越密切。近年來,各種人類**轉(zhuǎn)基因動物模型不斷建立。如轉(zhuǎn)基因動物在遺傳病、心血管**、腫瘤、血壓病、病毒性**、異種移植、輸血醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)研究中的應(yīng)用；利用轉(zhuǎn)基因動物-乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)**蛋白,好比在動物身上建“藥廠”,可以從動物乳汁中源源不斷地獲得具有穩(wěn)定生物活性的基因產(chǎn)品。這是種全新的**生產(chǎn)模式,具有投資成本低,**研制周期短和經(jīng)濟(jì)效益等點。 　　　　　　　　　　　　    f、中藥材真?zhèn)舞b別　利用DNA分子的特征進(jìn)行物種鑒別的DNA分子標(biāo)記鑒別法,與現(xiàn)有的中藥鑒別方法相比具有以下主要特點:1)準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性好,真實、穩(wěn)定、可靠;2)不受樣品形態(tài)的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等)均可應(yīng)用;3)所需檢樣量少,對**藥材及化石標(biāo)本的鑒定更具應(yīng)用價值;4)PCR技術(shù)的快速、便捷性使得DNA分子標(biāo)記鑒別法更適宜推廣使用。
3、農(nóng)業(yè)科學(xué)
    a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。
    b、轉(zhuǎn)基因動物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。
4、環(huán)境科學(xué)
    a、環(huán)境生態(tài)研究 PCR-FLP技術(shù)為環(huán)境地球化學(xué)了種新的研究方法和實驗設(shè)計的新的思維方式。此方法具有所需樣品量低、快速簡便及特征性強(qiáng)等點,可廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)、環(huán)境過程的生物作用、生物多樣性及有機(jī)物源判斷等方面的研究。展望未來研究成果,將會在海洋及湖泊沉積物等自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)更多的、新的微生物種類；將進(jìn)步闡明生物作用和物質(zhì)循環(huán)的機(jī)理和過程；進(jìn)步闡明自然環(huán)境中生物大分子的變化機(jī)理及其環(huán)境效應(yīng)并找到判斷沉積物有機(jī)物。
    b、環(huán)境監(jiān)測 長期以來檢測外環(huán)境（水樣中的霍亂弧菌、空氣中產(chǎn)氣莢膜桿菌、海洋中已知病菌及有害生物如藻類等）均用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,既繁瑣耗時,檢出率又低，而用PCR方法能快速、準(zhǔn)確地檢測外環(huán)境致病性**盒有害生物。
5、考古學(xué)及歷史事件解讀
    利用人類短串聯(lián)重復(fù)STR-PCR技術(shù)，研究人類種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學(xué)、人類學(xué)和考古學(xué)等各個域中。
 

6、衛(wèi)生**
    a、食品微生物的檢測 傳統(tǒng)的致病菌檢測先經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，費時費力，應(yīng)用PCR技術(shù)則非常迅速、準(zhǔn)確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測；水中**指標(biāo)測定。

    b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測 目前轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對人體健康的危害及對生態(tài)的影響也日受廣泛的重視，因此對轉(zhuǎn)基因食品的檢測成為控制其泛濫的種手段。
    c、動、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我進(jìn)出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入門的人員、動、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染?。ò?、動物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于門之外，是提我綜合力的必要保證。