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雙向電泳完整操作步驟
()第向等電聚焦
1. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)小管(1ml/管),置室溫溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT, Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混勻。
3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液,加入100ml樣品,充分混勻。
4. 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條(17cm pH 4-7),室溫中放置10分鐘。
5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣,中間的樣品液定要連貫。注意:不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。
6. 當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后,用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。
7. 分清膠條的正負(fù),輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上,使得膠條的正(標(biāo)有+)對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正。確保膠條與電緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上,因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡,用鑷子輕輕地提起膠條的端,上下移動(dòng)膠條,直到氣泡被趕到膠條以外。
8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油,防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油,沿著膠條,使礦物油滴滴慢慢加在塑料支撐膜上。
9. 對(duì)好正、負(fù),蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。
10.聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第向SDS-PAGE電泳,否則將膠條置于樣品水化盤中,-20℃冰箱保存。
()第向SDS-PAGE電泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液,每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板夾層中,上部留1cm的空間,用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面,保持膠面平整。聚合30分鐘。般凝膠與上方液體分層后,表明凝膠已基本聚合。
2. 待凝膠凝固后,倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇,用MilliQ水沖洗。
3. 從-20℃冰箱中取出的膠條,先于室溫放置10分鐘,使其溶解。
4. 配制膠條平衡緩沖液I。
5.在桌上先放置干的厚濾紙,聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另份厚濾紙用MilliQ水浸濕,擠去多余水分,然后直接置于膠條上,輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。
6. 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中,每個(gè)槽根膠條,在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
7. 配制膠條平衡緩沖液II。
8. 第次平衡結(jié)束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。再加入膠條平衡緩沖液II,繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
9. 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第向凝膠放在桌面上,長玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝膠的頂部對(duì)著自己。
10.將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。
11.將10×電泳緩沖液,用量筒稀釋10倍,成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
12.第次平衡結(jié)束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。
13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出,用鑷子夾住膠條的端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。
14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上,短玻璃板面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。
15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí),要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜,不要碰到膠面。
16.放置5分鐘,使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。
17.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。
18.在電泳槽加入電泳緩沖液后,接通電源,起始時(shí)用的低電流(5mA/gel/17cm)或低電壓,待樣品在完全走出IPG膠條,濃縮成條線后,再加大電流(或電壓)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。
19.電泳結(jié)束后,輕輕撬開兩層玻璃,取出凝膠,并切角以作記號(hào)(戴手套,防止污染膠面)。
20.進(jìn)行染色。
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