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瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程

日期:2024-10-19 08:55
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摘要:瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程

那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程:

凝膠電泳操作注意事項(xiàng):

1. 緩沖系統(tǒng):在沒有離子存在時(shí),電導(dǎo)率*小,DNA不遷移,或遷移極慢,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中,電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱,可能導(dǎo)致DNA變性,因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí),常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。

2. 瓊脂糖:不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖,其雜質(zhì)含量不同,影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度,應(yīng)有選擇地使用。

3. 凝膠的制備:凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致,溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中,避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡,影響電泳結(jié)果。

4. 樣品加入量:一般情況下,0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量,加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定,過多的量會(huì)造成加樣孔超載,從而導(dǎo)致拖尾和彌散,對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。

5. 電泳系統(tǒng)的變化會(huì)影響DNA的遷移,加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的。

6. DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率,平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。

7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度,遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子,制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。

 

瓊脂糖加樣時(shí)候注意事項(xiàng):

1、 用移液搶將樣品加至點(diǎn)樣孔。每孔點(diǎn)樣的體積一般少于25ul,因此吸取每一個(gè)樣品時(shí),操作要穩(wěn)當(dāng)且細(xì)心。

2、 常加一定量的蔗糖來增加樣品的濃度,以使每個(gè)樣品停留在各自的點(diǎn)樣孔中。

3、 在樣品中加入水溶性的陰離子追蹤染料(如溴酚藍(lán)),用以看出樣品移動(dòng)的距離。

4、 在一個(gè)或幾個(gè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量樣品,電泳結(jié)束后,根據(jù)已知分子質(zhì)量的帶的相應(yīng)位置可用來做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5、 電泳一般是在追蹤染料泳動(dòng)到膠的80%部位時(shí)停止。注意電泳期間,電泳槽蓋要**蓋好,以防止液體蒸發(fā),又可以降低電擊的可能性。

6、 電泳結(jié)束后,將膠浸沒在1mg/L的溴化乙錠(EB)中,5min后即可看到DNA帶,EB通過插入在雙螺旋的配對(duì)核苷酸之間同NDA結(jié)合。另一種方法是電泳時(shí),在膠中加入EB。

7、 在紫外燈下,由于EB發(fā)出強(qiáng)烈的橘紅色的熒光,所以可以看到DNA帶。利用這種方法檢測(cè)的界限是每條帶約10ng DNA。帶上塑料**眼鏡可防止紫外光對(duì)眼睛的傷害??捎贸咦觼頊y(cè)量每條帶至點(diǎn)樣孔的距離。同樣,利用特制的照相機(jī)和調(diào)焦器,也可以對(duì)凝膠拍照。

8、 如果要對(duì)某一條帶(如質(zhì)粒)進(jìn)一步分析,可用小刀將含該帶的凝膠切割下來,從帶中回收DNA。

 

瓊脂糖核酸電泳實(shí)驗(yàn)操作流程

1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈,放在制膠平板上,封閉模具邊緣,架好梳子;

2.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠:準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉,加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi),定量加入電泳緩沖液(一般20~30 ml);

3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻,加入一滴熒光染料,輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液,倒入電泳槽中,待其凝固;

4.室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結(jié),小心拔出梳子,將凝膠安放在電泳槽內(nèi);

5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mm為宜,如樣品孔內(nèi)有氣泡,應(yīng)設(shè)法除去;

6.在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液(loading buffer),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi);

7.接通電源,紅色為正極,黑色為負(fù)極,切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng) (靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60~100V電壓,電泳20~40min即可;

8. 根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置,判斷是否終止電泳;

9.電泳完畢,關(guān)上電源,在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 

瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的*佳分辨范圍

瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的*佳分辨范圍(bp)

0.5%1,000~30,000

0.7%800~12,000

1.0%500~10,000

1.2%400~7,000

1.5%200~3,000

2.0%50~2,000

 

以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程。

 

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