蛋白純化經(jīng)驗(yàn)指南（含避坑清單）

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蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來(lái)，是非常復(fù)雜的過(guò)程，有哪些坑，一起來(lái)看看師兄們?yōu)槟闾说穆钒?

蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。一般蛋白純化采用的方法為樹(shù)脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬，并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，必要時(shí)可加入相應(yīng)的保護(hù)劑（例如蛋白酶抑制劑），防止目的蛋白被降解。

精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹(shù)脂與目的蛋白結(jié)合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個(gè)從樹(shù)脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)三步。

分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。為此，動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子*好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，將組織和細(xì)胞破碎。動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)胞的破碎比較麻煩，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個(gè)借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來(lái)。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過(guò)濾的方法除去。

如果所要的蛋白主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開(kāi)，收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類(lèi)）獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。

細(xì)分離
樣品經(jīng)粗分級(jí)分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為*后的純化步驟。用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。

結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的*后步驟。盡管結(jié)晶過(guò)程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過(guò)程中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白，因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。

當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH等辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

蛋白質(zhì)純化有機(jī)溶劑提取的原理是：與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。

例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀，而且伴隨著變性。因此,通常要將有機(jī)溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過(guò)高,蛋白質(zhì)變性問(wèn)題就可以很大程度上得到解決。對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取mian yi球蛋白*早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規(guī)程和中國(guó)生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種成分,而且有抑菌、清理和滅病毒的作用。

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