蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（一）

那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關(guān)于蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（一）：

蛋白質(zhì)純化工藝的建立

建立蛋白質(zhì)純化工藝時(shí)，*重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的數(shù)量及純度都必須滿足實(shí)驗(yàn)分析要求。而且，因?yàn)楹罄m(xù)研究需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)行為的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過程中，很多處理方法都會(huì)對蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細(xì)計(jì)劃，在*短時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在*穩(wěn)定的條件下進(jìn)行保存才算是成功地完成了其整個(gè)純化過程。
每一步純化過程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個(gè)良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。

緩沖液是一種含有共軛酸/堿對的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時(shí)的pH值 （圖1）。

Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當(dāng)pH=8.06，50%的Tris是質(zhì)子化（酸式結(jié)構(gòu)），50%是去質(zhì)子化（堿式結(jié)構(gòu)）。
關(guān)于緩沖液的一個(gè)常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時(shí)有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時(shí)可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。
一種好的緩沖液必須具有以下特征  :1、水溶性2、化學(xué)穩(wěn)定性3、在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力4、與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件具有良好的兼容性5、與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性
很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。*常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種*常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對蛋白質(zhì)純化過程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點(diǎn)。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。

緩沖液	pH范圍	優(yōu)缺點(diǎn)
磷酸緩沖液	5.8-8.0	pH值不隨溫度變化 便宜 紫外無吸收 不能與二價(jià)陽離子一起使用
MOPS緩沖液	6.5-7.9	不能高壓滅*菌處理 pH值一定程度上隨溫度變化 在生理pH值范圍內(nèi)具有高緩沖能力
HEPES緩沖液	6.8-8.2	不能高壓滅*菌處理 pH一定程度上隨溫度變化 一定條件下會(huì)生成自由基
Tris緩沖液	7.5-9.0	pH值在一定程度上隨溫度或稀釋程度變化 便宜 會(huì)對部分酶活性造成影響  紫外無吸收

表一：蛋白質(zhì)純化中*常用的生物緩沖液

緩沖液在一定pH值范圍內(nèi)可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會(huì)對某些層析過程或者分析實(shí)驗(yàn)造成影響。

溶液添加劑

除了一個(gè)合適的緩沖液體系，蛋白質(zhì)純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和活性方面均具有一定作用的成分。
溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會(huì)添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因?yàn)榇藭r(shí)幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標(biāo)蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護(hù)蛋白質(zhì)不被破壞和增強(qiáng)其溶解性。

類型	功能	常用試劑
還原劑	防止氧化	2-mercaptoethanol （BME） Dithiothreiotol （DTT） Tris （2-carboxyethyl） phosphine （TCEP）
蛋白酶抑制劑	防止內(nèi)源性蛋白酶分解蛋白	亮抑肽酶 （絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑） 抑胃肽 （天冬氨酸蛋白酶抑制劑） PMSF （絲氨酸蛋白酶抑制劑）
金屬螯合劑	使金屬蛋白酶失活	EDTA EGTA
精氨酸激酶	穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)溶解性	丙三醇 去污劑（如CHAPS，NP-40，Triton X-100） 糖（如葡萄糖、蔗糖等）
離子穩(wěn)定劑	增強(qiáng)溶解性	鹽類 （如NaCl、KCl、（NH4）2SO4

表二：蛋白質(zhì)純化中用于增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常用添加劑。

添加劑只在必要時(shí)才使用?？赡苄枰啻螄L試才能確定某些添加劑是否對一些特定蛋白質(zhì)的純化工藝有效。

蛋白質(zhì)純化工藝中的其他因素也會(huì)對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。對蛋白質(zhì)的處理步驟越少越好，在*短時(shí)間內(nèi)采用*少步驟的純化工藝才能保證得到*高產(chǎn)率的活性蛋白質(zhì)。而且，在整個(gè)純化過程中，蛋白質(zhì)*好都保持在低溫狀態(tài)。一般純化過程都在4°C進(jìn)行,因?yàn)檫@個(gè)溫度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情況下），又可以保證蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。
開始純化蛋白前應(yīng)先制備初始樣品。真正進(jìn)行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來源。樣品來源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。雖然后基因組學(xué)領(lǐng)域的研究者很少使用原始組織純化蛋白，但當(dāng)研究者想要關(guān)聯(lián)某一蛋白序列的催化活性時(shí)，會(huì)有這樣的需求。
當(dāng)前，更為常見的是從重組來源的樣品純化蛋白質(zhì)。一些重要決定需要提前考慮以便優(yōu)化后續(xù)的純化。研究者需要考慮蛋白質(zhì)的*終用途（例如酶測定，結(jié)構(gòu)研究，抗體生成），因?yàn)檫@將決定*終蛋白質(zhì)制備所需的量和純度。盡管蛋白質(zhì)表達(dá)的詳細(xì)討論超出本文范圍，但是在這一點(diǎn)上仍有幾個(gè)值得考慮的基本點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懞罄m(xù)的蛋白純化。
哪個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)水平*高？一般規(guī)則是，表達(dá)水平越高，越容易獲得大量高度純化蛋白。如果選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，*終目的可溶性表達(dá)或不可溶表達(dá)是包涵體形式嗎？由于包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構(gòu)成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨后包涵體中再折疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的*終產(chǎn)量相平衡。已經(jīng)有許多工作優(yōu)化了從包涵體中產(chǎn)生功能蛋白的產(chǎn)量。
另一個(gè)考慮是是否靶向胞內(nèi)或胞外（分泌的）表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)需要將蛋白質(zhì)從大量宿主細(xì)胞蛋白中純化而來。相比之下，特別是當(dāng)宿主細(xì)胞在無血清條件下生長時(shí)，目標(biāo)蛋白的有效分泌要求蛋白必須從少量分泌的宿主蛋白中純化而來。

        以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（一）。

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